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Western Blot 常見問題分析(三)

發布時間:2020/6/2 15:41:05      閱讀次數:1508

前兩周的“Western Blot 常見問題分析”中,我們主要分享了一些異常的實驗結果,今天我們來講講關于Western Blot實驗可能會存在的疑惑.話不多說,直接上貨:


1.Western實驗中,用TBS還是PBS?

選擇合適的緩沖液對于維持一定pH值下蛋白質的穩定及保證實驗的重復性很重要.PBS的緩沖能力強于TBS,TBS在pH7.0以下緩沖能力較弱.一般根據實驗目的選用合適的緩沖液,如在蛋白純化中進行陰離子交換層析,陽離子緩沖液選TBS;陽離子交換層析時,陰離子緩沖液選PBS.Western blot中使用PBS和TBS均可,根據需要選擇合適的濃度.


2. 沒有注明可以用來做Western blot的一抗,可以用來做Western blot嗎?

不一定,因為有的抗體是識別線性表位的,有的是識別構象型表位,識別構象型表位的抗體不能用于Western blot,因為在Western blot中抗體識別的是完全變性的蛋白質抗原,而蛋白質抗原的構象型表位變性時被破壞.


3.做Western每次只加一種一抗,可以同時加兩種或者多種一抗嗎?

不要同時加兩種一抗,因為如果結果里面有非特異性信號的話,就說不清楚.做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照,也是先上目的蛋白的一抗 二抗 ECL顯色 壓片 洗片,漂洗后加內對照的一抗 二抗 ECL顯色 壓片,洗片.


4. Western用的一抗,單抗好些還是多抗好些?

做Western來講,理論上單抗比多抗的特異性要好但價格偏高,一般來說多抗就OK了.用于Western的抗體和用于ELISA的抗體,一般來說用于Western的抗體識別的是氨基酸序列特異性,而可用于ELISA的抗體要看抗原種類,有些是識別氨基酸序列特異性,有些是識別構象特異性,所以一般根據說明書來確定.做免疫印跡選擇抗體主要考慮兩個問題,一是所選抗體是否識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白,另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶.


5. 半干轉是否要取膜 濾紙 膠同樣大小,因為膠大小不一定規則,膜和濾紙會大一點,那樣會不會短路?

可以相等,但是如果濾紙 膜比凝膠大就比較容易形成短路了,上下兩層濾紙也不能因過大而相互接觸,這樣會短路,電流不會通過膠和濾紙.轉移前和轉移過程中看看電壓就行,正常的半干轉是慢慢變高的,結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的.


6. 不能很好的將大分子量蛋白轉移到膜上,轉移效率低怎么解決?

大分子量蛋白傾向于在膠里沉淀,阻礙轉移.可以考慮:在轉膜緩沖液里加入終濃度0.1%的SDS有助于增加轉移效率;轉移緩沖液中加入20%甲醇,甲醇可以降低蛋白質洗脫效率,增加蛋白質和NC膜的結合能力,防止凝膠變形,延長大分子量蛋白轉移時間;用4℃濕轉過夜代替半干法轉膜.


 
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